In dit laatste deel kun je eigen sgRNAs ontwerpen om een tomaat virus-resistent te maken met CRISPR-Cas9.
Maak een stroomdiagram (voor op je poster) van de stappen die je doorloopt, en laat de posities van de 2 sgRNAsgRNAs in de sequenties zien. Geef aan waar de PAM sequenties zitten, en waar de complementaire sequentie van het sgRNA.
Geef schematisch aan waar je mutaties verwacht.
We gaan uit van hetzelfde gen als this last part you can design your own sgRNAs to make a tomato virus-resistant, using CRISPR/Cas9.
Create a flow chart (for your poster) of the steps you go through, and show the positions of the 2 sgRNAs in the sequences. Indicate where the PAM sequences are, and where the complementary sequence of the sgRNA.
Indicate schematically where you expect mutations.
We start from the same gene as J. Chandrasekaran et al. gebruikten (zie deel See part 2), namelijk het gen namely the gene eukaryotic translation initiation factor 4Ei, maar dan but in tomaattomato.
Zoek de DNA-sequentie op van dit gen in tomaat. Je kunt daarbij gebruik maken van info opFind the DNA sequence of this gene in tomato. You can use info on:
https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AY723733
VragenAsk:
- Heeft dit gen intronen?
- Hoe lang is het gen?
- Wat is de DNA-sequentie van dit gen in tomaat?
Open een site voor ontwerpen van sgRNAsgRNAs 1. Does this gene have introns?
2. How long is the gene?
3. What is the DNA sequence of this gene in tomato?
Open a site for designing sgRNAs: http://crispor.tefor.net/
Lees de tekst bovenin deze site. Ga dan naar Step 1., en kopieer je DNA-sequentie van het tomaten-gen.
De software gaat sgRNAs zoeken, maar test daarbij ook of deze guides het Cas-eiwit naar andere plaatsen in het tomatengenoom kan leiden, wat zou kunnen leiden tot een knip op een ongewenste plaats, ook wel off-target genoemd. In verband daarmee vraagt de software naar het organisme. Vul dit in bij Step 2 (de Latijnse naam voor tomaat Read the text at the top of this site. Then go to Step 1. and copy your DNA sequence from the tomato gene.
The software is looking for sgRNAs, but also tests whether these guides may lead the Cas protein to other places in the tomato genome, which could lead to a cut in an unwanted place, also called off-target. In view of this, the software asks for the organism. Enter this in Step 2 (the scientific name for tomato is Solanum lycopersicum).
Kies bij Choose at Step 3 het Cas-eiwit dat je wilt gaan gebruiken.
4. Kies hier SpCas9. Waarom vraagt de software hiernaar?
5. Wat is de PAM-sequentie voor dit Cas-eiwit?
Druk op SUBMIT.
De software zoekt naar PAM-sites. Vervolgens neemt het de 20 basen voorafgaand aan die PAM-site. De complementaire sequentie van die 20 bp is de voorgestelde sgRNA.
Vervolgens gaat de software iedere combinatie van sgRNA en PAM-site testen of die ook op andere plaatsen in het tomatengenoom voorkomt, en daar zou kunnen knippen. Dit zoeken duurt het enige tijd. Als het goed is krijg je binnen een minuut de resultaten.
6. Kijk naar de sequentie in het grijze vak. Wat is hier weergegeven met groene, gele en rode letters?
7. Selecteer twee sgRNAs. Motiveer waarom (welke criteria) je juist deze twee hebt gekozen.
8. Verwacht je off target effecten van deze sgRNAs? Licht toe.
9. Op welke positie(s) van het gen verwacht je mutaties, als je beide sgRNAs in de plant zet?
10. Wat kan er gebeuren als op beide plaatsen tegelijkertijd geknipt wordt?
Waar zou je primers ontwerpen, als je later in een PCR-reactie wilt screenen op mutaties en deleties? Geef die primers duidelijk aan in de figuur met de sequentie en sgRNA locaties op je the Cas protein that you want to use.
4. Select SpCas9 here. Why does the software ask for this?
5. What is the PAM sequence for this Cas protein?
Press SUBMIT.
The software searches for PAM sites. Then it takes the 20 bases prior to that PAM site. The sequence of that 20 bp is the proposed sgRNA.
Then the software will test every combination of sgRNA and PAM-site whether that also occurs in other places in the tomato genome, and may cut there. This search takes some time. If all goes well you will get the results within a minute.
6. Look at the sequence in the grey box. What is shown here with green, yellow and red letters?
7. Select two sgRNAs. Motivate why (which criteria) you have chosen these two.
8. Do you expect off target effects from these sgRNAs? Explain.
9. At what position (s) of the gene do you expect mutations, if you put both sgRNAs in the plant?
10. What can happen if both locations are cut at the same time?
Where would you design primers if you later screened for mutations and deletions in a PCR reaction? Identify those primers clearly in the figure with the sequence and sgRNA locations on your poster.