Ontwerp je eigen SgRNAsgRNAs
In dit laatste deel kun je eigen sgRNAs ontwerpen om een tomaat virus-resistent te maken met CRISPR-Cas9.
Maak een stroomdiagram (voor op je poster) van de stappen die je doorloopt, en laat de posities van de 2 sgRNAsgRNAs in de sequenties zien. Geef aan waar de PAM sequenties zitten, en waar de complementaire sequentie van het sgRNA.
Geef schematisch aan waar je mutaties verwacht.
We gaan uit van hetzelfde gen als J. Chandrasekaran et al. gebruikten (zie deel 2), namelijk het gen eukaryotic translation initiation factor 4Ei, maar dan in tomaat.
Zoek de DNA-sequentie op van dit gen in tomaat. Je kunt daarbij gebruik maken van info op:
https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/AY723733
Vragen:
- Heeft dit gen intronen?
- Hoe lang is het gen?
- Wat is de DNA-sequentie van dit gen in tomaat?
Open een site voor ontwerpen van sgRNAsgRNAs: http://crispor.tefor.net/
Lees de tekst bovenin deze site. Ga dan naar Step 1., en kopieer je DNA-sequentie van het tomaten-gen.
De software gaat sgRNAs zoeken, maar test daarbij ook of deze guides het Cas-eiwit naar andere plaatsen in het tomatengenoom kan leiden, wat zou kunnen leiden tot een knip op een ongewenste plaats, ook wel off-target genoemd. In verband daarmee vraagt de software naar het organisme. Vul dit in bij Step 2 (de Latijnse naam voor tomaat is Solanum lycopersicum).
Kies bij Step 3 het Cas-eiwit dat je wilt gaan gebruiken.
4. Kies hier SpCas9. Waarom vraagt de software hiernaar?
5. Wat is de PAM-sequentie voor dit Cas-eiwit?
Druk op SUBMIT.
De software zoekt naar PAM-sites. Vervolgens neemt het de 20 basen voorafgaand aan die PAM-site. De complementaire sequentie van die 20 bp is de voorgestelde sgRNA.
Vervolgens gaat de software iedere combinatie van sgRNA en PAM-site testen of die ook op andere plaatsen in het tomatengenoom voorkomt, en daar zou kunnen knippen. Dit zoeken duurt het enige tijd. Als het goed is krijg je binnen een minuut de resultaten.
6. Kijk naar de sequentie in het grijze vak. Wat is hier weergegeven met groene, gele en rode letters?
7. Selecteer twee sgRNAs. Motiveer waarom (welke criteria) je juist deze twee hebt gekozen.
8. Verwacht je off target effecten van deze sgRNAs? Licht toe.
9. Op welke positie(s) van het gen verwacht je mutaties, als je beide sgRNAs in de plant zet?
10. Wat kan er gebeuren als op beide plaatsen tegelijkertijd geknipt wordt?
Waar zou je primers ontwerpen, als je later in een PCR-reactie wilt screenen op mutaties en deleties? Geef die primers duidelijk aan in de figuur met de sequentie en sgRNA locaties op je poster.