Planten resistent maken tegen virussen door ‘transplantatie’ van het bacteriële CRISPR-Cas afweersysteem naar de plant
Verschillende bacteriesoorten hebben immuunsystemen ontwikkeld tegen virussen. Eén immuunsysteem heet CRISPR-Cas. De bacterie knipt met CRISPR-Cas het DNA van virussen die de bacterie binnendringen. Zhang et al. (2018) (https://doi.org/10.1111/pbi.12881) hebben zo’n CRISPR-Cas systeem, afkomstig uit een bacterie, in de plant gezet, met als doel planten resistent te maken tegen virussen. Het bacteriële immuunsysteem is als het ware getransplanteerd naar de plant.
- Lees het abstract van dit artikel zorgvuldig door.
- Lees ook de Introduction.
- Lees de eerste paragraaf van de resultaten
- Bestudeer figuur 1A (Pagina 1417)
en beantwoord dan de volgende vragen:
- Wat is het doel van dit onderzoek?
- Moet CRISPR-Cas hier een plantengen knippen of een virusgen?
- Beschrijf het principe van de resistentie. Hoe werkt het?
- Typen virussen
- Voor welke twee virussoorten is de resistentie ontwikkeld?
- Zoek (online) op wat voor typen virussen er allemaal zijn volgens de Baltimore classificatie.
- Tot welke groep van Baltimore behoren de twee virussen uit vraag 4a?
- In dit artikel wordt gesproken over RNA-virussen, oftewel virussen die geen DNA hebben, maar RNA. Cas9 knipt normaal gesproken in DNA, maar niet in RNA! Hoe hebben de auteurs dit opgelost? Lees hierover het einde van de Introduction en de eerste paragraaf van de Discussion.
- CRISPR-Cas bestaat uit 2 onderdelen: Het CRISPR-deel en het Cas-deel. Het Cas-gen codeert voor het Cas eiwit. Het Cas-eiwit knipt in DNA of RNA. De plaats waar die knip wordt aangebracht wordt bepaald door de single stranded guide RNA (sgRNA, ook wel gRNA genoemd) in het CRISPR-deel.
- Leg uit hoe dit werkt. Als je wilt, kun je bij je uitleg verwijzen naar het onderste deel van Fig. 1A.
- Ik zei net “De plaats waar die knip wordt aangebracht wordt bepaald door de sgRNAsgRNAs in het CRISPR-deel.” Dat klopt, maar er is een element dat de specificiteit nog verder verhoogt. Welk element?
- Hoe wordt de specificiteit bereikt van het CRISPR/Cas9 systeem, waardoor het tegen specifieke virussen werkt, maar niet tegen andere virussen? Knipt het ook in planten-RNA?
Results. Figuur 1.
Figuur 1A laat de opbouw zien van het T-DNA dat de onderzoekers hebben gebouwd, en in een vector hebben gezet. Die vector hebben ze in Agrobacterium tumefaciens gebracht, en vervolgens heeft A. tumefaciens het stukje DNA tussen de left border (LB) en right border (RB) in de plant gebracht. Het stukje DNA tussen deze twee borders heet T-DNA (transfer DNA).
6. Zoek op welke onderdelen. Benoem alle componenten van het T-DNA in Figuur 1A, en geef voor iedere component de functie.
Om op gang te helpen:
LB = left border, dit is de linker grens van het T-DNA in A. tumefaciens.
Nog meer Hulp:
NOS en Ter zijn ‘terminators’. Wat is de functie van een terminator?
7. Uit welke bacterie is het hier gebruikte Cas-gen afkomstig? Waarom is deze bacterie gekozen, en niet een veel gangbaardere bacterie, zoals Streptococcus?
8. Leg het onderste deel van Fig. 1A uit. Wat is hier afgebeeld?
9. Wat wordt in Fig. 1B aangegeven?
10. En wat in Fig. 1C?
Lees de paragrafen “Screening of the sgRNA–FnCas9 target sites” en “Establishing resistance in tobacco”
11. In Fig. 1d, e, en f worden de resultaten getoond. Wat wordt bedoeld met Mock vector? En wat bevatten de andere vectoren? Wat willen de auteur laten zien met deze staafdiagrammen?
Figuur 5.
12. Lees de paragraaf “Establishing stable resistance in Arabidopsis”, en lees Figuur 5. In Figuur 1 waren de onderzoekers nog bezig met een transiënte test. Dat wil zeggen dat T-DNA in blad werd geïnfiltreerd, en op die plek een poosje actief was. Maar er werden geen transgene planten gemaakt waarbij iedere cel het T-DNA had ingebouwd. In Figuur 5 is dat anders. Daar zijn wel transgene planten gemaakt, waarbij het T-DNA stabiel is ingebouwd in het DNA van iedere cel van de plant.
- In Figuur 5A worden 9 planten getoond. Wat bedoelen de auteurs met de 3 codes bij de bovenste rij van 3 planten? Tip: een kleine letter “p” wijst erop dat het een naam van een vector (p van plasmide) is.
- Bij welke planten in Fig. 5A is een CRISPR-Cas construct ingebouwd tegen het CMV-virus, en bij welke planten niet? Wat valt je op bij de planten met een CRISPR-Cas construct in vergelijking met de planten zonder zo’n construct?
- Wat willen de auteurs duidelijk maken met Fig. 5 b, c, en d?
- T2-planten zijn planten uit de zelfbestuiving van een transgene moederplant (T1). Zal een transgene moederplant homozygoot of heterozygoot zijn voor de T-DNA insertie?
- Als je zelfbestuiving toepast bij een moederplant met 1 T-DNA insertie, hoeveel procent van de T2-nakomelingen zullen dan het transgen niet bevatten, en hoeveel procent het transgen wel?
- Hoeveel procent van de T2-nakomelingen zou dan resistent moeten zijn? Verwacht je een verschil in resistentieniveau tussen nakomelingen die homozygoot zijn voor de insertie en nakomelingen die heterozygoot zijn voor de insertie?